高光譜熒光成像技術在活體醫學上的應用

隨(sui)著(zhe)科(ke)學(xue)技(ji)術(shu)的(de)發(fa)展(zhan)
，分(fen)子(zi)成(cheng)像(xiang)技(ji)術(shu)已(yi)經(jing)與(yu)包(bao)括(kuo)遺(yi)傳(chuan)工(gong)程(cheng)模(mo)式(shi)動(dong)物(wu)在(zai)內(nei)的(de)動(dong)物(wu)研(yan)究(jiu)策(ce)略(lve)有(you)效(xiao)地(di)結(jie)合(he)在(zai)一(yi)起(qi)。這(zhe)項(xiang)技(ji)術(shu)可(ke)以(yi)實(shi)現(xian)無(wu)損(sun)傷(shang)的(de)在(zai)動(dong)物(wu)體(ti)內(nei)評(ping)價(jia)代(dai)表(biao)治(zhi)療(liao)效(xiao)果(guo)的(de)分(fen)子(zi)和(he)細(xi)胞(bao)事(shi)件(jian)

，因(yin)此(ci)可(ke)以(yi)利(li)用(yong)同(tong)一(yi)組(zu)動(dong)物(wu)進(jin)行(xing)長(chang)時(shi)間(jian)的(de)研(yan)究(jiu)，從(cong)而(er)大(da)大(da)減(jian)少(shao)了(le)實(shi)驗(yan)動(dong)物(wu)的(de)使(shi)用(yong)數(shu)量(liang)。更(geng)為(wei)有(you)力(li)的(de)是(shi)，由(you)於(yu)一(yi)係(xi)列(lie)的(de)數(shu)據(ju)來(lai)源(yuan)於(yu)同(tong)一(yi)隻(zhi)或(huo)同(tong)一(yi)組(zu)動(dong)物(wu)
，以(yi)自(zi)身(shen)作(zuo)為(wei)內(nei)對(dui)照(zhao)，大(da)大(da)增(zeng)加(jia)了(le)數(shu)據(ju)的(de)可(ke)靠(kao)性(xing)。

通過活體動物體內成像係統
，可觀測到疾病或癌症的發展進程以及藥物治療所產生的反應

，並可用於病毒學研究、構建轉基因動物模型、siRNA研究、幹細胞研究、蛋白質相互作用研究以及細胞體外檢測等領域。

1 癌症與抗癌藥物研究

直zhi接jie快kuai速su地di觀guan察cha各ge種zhong癌ai症zheng模mo型xing中zhong腫zhong瘤liu的de生sheng長chang和he轉zhuan移yi，並bing可ke對dui癌ai症zheng治zhi療liao中zhong癌ai細xi胞bao的de變bian化hua進jin行xing實shi時shi觀guan測ce和he評ping估gu。活huo體ti生sheng物wu發fa光guang成cheng像xiang能neng夠gou無wu創chuang傷shang地di定ding量liang檢jian測ce小xiao鼠shu整zheng體ti的de原yuan位wei瘤liu、轉移瘤及自發瘤。精諾真生物成像技術提高了檢測的靈敏度
，即使微小的轉移灶也能被檢測到(可以檢測到體內100個細胞的微轉移)。目前已商品化的腫瘤細胞株包括:前列腺癌，黑色素瘤，乳腺癌，肺癌，子宮頸癌和結腸癌等BiowareTM細胞係模型。Rehemtulla等人采用攜帶前體藥物轉化酶和酵母胞咯吮脫氨酶基因的腺病毒載體，運用活體成像技術與磁共振成像技術(magnetic resonance imaging, MRI)研究了其作為轉基因治療藥物在癌症治療中的效果。

2 免疫學與幹細胞研究

    jiangyingguangsumeibiaojidezaoxueganxibaoyizhirenpijigusui，keyongyushishiguancedongwuhuotitineiganxibaozaoxueguochengdezaoqishijianjidonglixuebianhua。youyanjiubiaoming
，yingyongdaiyoushengwufaguangbiaojijiyindexiaoshulinbaxibao，jiancefangshejihuaxueyaowuzhiliaodexiaoguo，xunzhaozaizhongliugusuizhuanyijikangzhongliumianyizhiliaozhongfuzadexibaojizhi。yingyongkejianguanghuotichengxiangyuanlibiaojixibao
，jianlidongwumoxing，keyouxiaodizhenduitongyizudongwujinxinglianxudeguancha
，jieyuedongwuyangpinshu，tongshinenggengkuaijiedidedaomianyixitongzhongbingyuantidezhuanyitujingjikangxingdanbaibiaodadegaibian。

jinnianlai，bushaobaodaojieshaoleyingyonghuotichengxiangjishuyanjiumianyixibaoqianyideshili。qiyishiliyongrenduofaxingyinghuazhengdexiaoshumoxingguanchashiyanxingzimianyinaojisuiyanzhongzishenkangyuanfanyingxingCD4+T細胞的遷移模式。包含熒光素酶和GFP基因的逆轉錄病毒載體處理特定的CD4+T細胞。首先用流式細胞儀分選GFP發光的細胞，然後分別注人對照及實驗組動物體內。熒光素酶在活體的發光情況表明標記的CD4+T細胞遷移至中樞神經係統，而GFP可以進一步用於這些細胞的組織學定位。雙功能報告基因的應用極大地方便了特定免疫細胞的篩選及遷移研究。

3 細胞凋亡

在正常生理條件下，細胞增殖和凋亡是嚴格協調的，這種平衡一旦打破，就會導致一係列的疾病，包括AIDS

、神經退行性疾病、脊髓炎綜合症、缺血/再zai灌guan注zhu損sun傷shang及ji腫zhong瘤liu等deng等deng。當dang熒ying光guang素su酶mei與yu抑yi製zhi多duo肽tai以yi融rong合he蛋dan白bai形xing式shi在zai哺bu乳ru動dong物wu細xi胞bao中zhong表biao達da，產chan生sheng的de融rong合he蛋dan白bai無wu熒ying光guang素su酶mei活huo性xing，細xi胞bao不bu能neng發fa光guang
，而er當dang細xi胞bao發fa生sheng凋diao亡wang時shi
，活huo化hua的decaspase-3在特異識別位點切割去掉抑製蛋白，恢複熒光素酶活性，產生發光現象，由此可用於觀察活體動物體內的細胞凋亡相關事件。

4標記病毒

1. 病毒侵染

以熒光素酶基因標記的HSV-1病毒為例
，可觀察到HSV-1病毒對肝髒、肺、脾及淋巴結的侵和病毒從血液係統進人神經係統的過程。多種病毒已被熒光素酶標記
，用於觀察病毒對機體的侵染過程。

2. 基因治療

基ji因yin治zhi療liao包bao括kuo在zai體ti內nei將jiang一yi個ge或huo多duo個ge感gan興xing趣qu的de基ji因yin及ji其qi產chan物wu安an全quan而er有you效xiao地di傳chuan遞di到dao靶ba細xi胞bao。目mu前qian，基ji因yin治zhi療liao主zhu要yao是shi以yi病bing毒du做zuo載zai體ti

，可ke應ying用yong熒ying光guang素su酶mei基ji因yin作zuo為wei報bao告gao基ji因yin用yong於yu載zai體ti的de構gou建jian，觀guan察cha目mu的de基ji因yin是shi否fou能neng夠gou在zai實shi驗yan動dong物wu體ti內nei持chi續xu高gao效xiao和he組zu織zhi特te異yi性xing表biao達da。這zhe種zhong非fei侵qin人ren方fang式shi具ju有you容rong易yi準zhun備bei
、低毒性及免疫反應輕微等優點。熒光素酶基因也可以插入脂質體包裹的DNA分子中，用來觀察脂質體為載體的DNA運輸和基因治療情況。

5標記細菌

    利li用yong細xi菌jun熒ying光guang素su酶mei基ji因yin可ke以yi分fen別bie標biao記ji革ge蘭lan氏shi陽yang性xing和he革ge蘭lan氏shi陰yin性xing細xi菌jun。常chang用yong的de幾ji十shi種zhong細xi菌jun都dou已yi被bei標biao記ji，用yong來lai進jin行xing細xi菌jun侵qin染ran和he抗kang生sheng素su藥yao物wu的de研yan究jiu。

    細菌侵染研究：可以用標記好的革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細菌侵染活體動物，觀測其在動物體內的繁殖部位
、數量變化及對外界因素的反應。

抗生素藥物研究：liyongbiaojihaodexijunzaidongwutineiduiyaowudefanying
，yiyaogongsiheyanjiujigoukeyongzhezhongchengxiangjishujinxingyaowushaixuanhelinchuangqiandongwushiyanyanjiu。jinnianlai，guojishangdaxingzhiyaogongsifenfenjiangjingnuozhenjishuzaidongwutineideshiyanjieguozuoweiFDA(美國食品和藥品檢驗局)藥物申報材料中非常重要的臨床前動物實驗部分。

6 基因表達和蛋白質相互作用

1. 組織特異性基因表達

熒光素酶是一類生物發光酶
，其中的Renilla熒光素酶和Firefly熒光素醉分別識別不同的底物。一種細胞可被這兩種熒光素酶標記：Renilla熒光素酶基因由一組成性穩定表達的啟動子驅動，作為內參
，反應細胞數量的變化

；Firefly熒光素酶基因由需要研究的組織特異性啟動子驅動。這樣Firefly熒光素酶發光信號的變化，在消除細胞數量變化的影響後就可反應特定的啟動子在動物體內的表達活性。

2. 蛋白質相互作用

觀察細胞中或活體動物體內兩種蛋白質的相互作用，是將熒光素酶基因分成兩段

，分別連接所研究的兩種蛋白之一的編碼DNA，然(ran)後(hou)導(dao)入(ru)細(xi)胞(bao)或(huo)動(dong)物(wu)體(ti)內(nei)表(biao)達(da)為(wei)融(rong)合(he)蛋(dan)白(bai)。當(dang)兩(liang)種(zhong)蛋(dan)白(bai)有(you)強(qiang)相(xiang)互(hu)作(zuo)用(yong)時(shi)，表(biao)達(da)的(de)熒(ying)光(guang)素(su)酶(mei)兩(liang)部(bu)分(fen)相(xiang)互(hu)靠(kao)近(jin)形(xing)成(cheng)有(you)活(huo)性(xing)的(de)熒(ying)光(guang)素(su)酶(mei)，在(zai)有(you)底(di)物(wu)存(cun)在(zai)時(shi)出(chu)現(xian)生(sheng)物(wu)發(fa)光(guang)
，反(fan)映(ying)出(chu)所(suo)研(yan)究(jiu)的(de)兩(liang)種(zhong)蛋(dan)白(bai)存(cun)在(zai)相(xiang)互(hu)作(zuo)用(yong)。應(ying)用(yong)此(ci)原(yuan)理(li)亦(yi)可(ke)用(yong)於(yu)研(yan)究(jiu)細(xi)胞(bao)信(xin)號(hao)傳(chuan)導(dao)途(tu)徑(jing)。

3. 阻斷RNA

通過對比生物發光的變化

，驗證在成年小鼠體內，注射雙鏈siRNA可以特異地阻遏基因表達。

7 轉基因動物模型

    為研究目的基因是在何時、何(he)種(zhong)刺(ci)激(ji)下(xia)表(biao)達(da)，將(jiang)熒(ying)光(guang)素(su)酶(mei)基(ji)因(yin)插(cha)人(ren)目(mu)的(de)基(ji)因(yin)啟(qi)動(dong)子(zi)的(de)下(xia)遊(you)
，並(bing)穩(wen)定(ding)整(zheng)合(he)於(yu)實(shi)驗(yan)動(dong)物(wu)染(ran)色(se)體(ti)中(zhong)，建(jian)立(li)轉(zhuan)基(ji)因(yin)動(dong)物(wu)模(mo)型(xing)。利(li)用(yong)其(qi)表(biao)達(da)產(chan)生(sheng)的(de)熒(ying)光(guang)素(su)酶(mei)與(yu)底(di)物(wu)作(zuo)用(yong)產(chan)生(sheng)生(sheng)物(wu)發(fa)光(guang)，反(fan)應(ying)目(mu)的(de)基(ji)因(yin)的(de)表(biao)達(da)情(qing)況(kuang)，從(cong)而(er)實(shi)現(xian)對(dui)目(mu)的(de)基(ji)因(yin)的(de)研(yan)究(jiu)。發(fa)育(yu)生(sheng)物(wu)學(xue)方(fang)麵(mian)可(ke)用(yong)於(yu)研(yan)究(jiu)動(dong)物(wu)發(fa)育(yu)過(guo)程(cheng)中(zhong)特(te)定(ding)基(ji)因(yin)的(de)時(shi)空(kong)表(biao)達(da)情(qing)況(kuang)，藥(yao)理(li)學(xue)研(yan)究(jiu)方(fang)麵(mian)可(ke)觀(guan)察(cha)藥(yao)物(wu)誘(you)導(dao)特(te)定(ding)基(ji)因(yin)表(biao)達(da)
，以(yi)及(ji)其(qi)它(ta)生(sheng)物(wu)學(xue)事(shi)件(jian)引(yin)起(qi)的(de)相(xiang)應(ying)基(ji)因(yin)表(biao)達(da)或(huo)關(guan)閉(bi)。如(ru)圖(tu)3所示。

研究者根據研究目的，將靶基因、靶細胞、病毒及細菌進行熒光素酶標記
，同時轉人動物體內形成所需的疾病模型，包括腫瘤、免疫係統疾病、感(gan)染(ran)疾(ji)病(bing)等(deng)等(deng)。可(ke)提(ti)供(gong)靶(ba)基(ji)因(yin)在(zai)體(ti)內(nei)的(de)實(shi)時(shi)表(biao)達(da)和(he)對(dui)候(hou)選(xuan)藥(yao)物(wu)的(de)準(zhun)確(que)反(fan)應(ying)，還(hai)可(ke)用(yong)來(lai)評(ping)估(gu)候(hou)選(xuan)藥(yao)物(wu)和(he)其(qi)它(ta)化(hua)合(he)物(wu)的(de)毒(du)性(xing)，為(wei)藥(yao)物(wu)在(zai)疾(ji)病(bing)中(zhong)的(de)作(zuo)用(yong)機(ji)製(zhi)及(ji)效(xiao)用(yong)提(ti)供(gong)方(fang)法(fa)。

8 藥效評價

對於一些需化學方法進行標記的物質，比如化學合成藥物
、納na米mi藥yao物wu及ji一yi些xie肽tai段duan等deng，隻zhi能neng通tong過guo化hua學xue合he成cheng的de方fang法fa與yu熒ying光guang染ran料liao進jin行xing偶ou連lian，檢jian測ce熒ying光guang的de發fa光guang情qing況kuang
，從cong而er實shi現xian活huo體ti示shi蹤zong的de目mu的de。目mu前qian應ying用yong較jiao多duo的de是shi對dui於yu一yi些xie腫zhong瘤liu靶ba向xiang藥yao物wu在zai活huo體ti內nei靶ba點dian的de識shi別bie
、研究蛋白質-蛋白質相互作用以及跟蹤化學藥物在體內的分布及代謝情況等。例如用CY5.5及CY7標記RGD肽段，研究其在尾靜脈注射不同時間裏對移植膠質瘤中細胞粘附分子Intergrin的特異性識別過程。在腫瘤藥物相關研究中，用CY5.5標記兩種脫氧核糖類似物CY5.5-2DG及CY5.5-NHS均可在小鼠活體水平上直接觀測到其對腫瘤的特異性識別作用。

9 監測器官移植

生物發光成像在器官移植的監測方麵得到很好的應用。其一是監測與器官移植密切相關的基因表達情況
，如肝移植中的血紅素加氧酶；其二是利用熒光素酶的標記和示蹤功能來揭示移植反應中移植物的動態表現包括排斥和存活情況等。Chen 等將熒光素酶轉基因鼠( FVB/NJ- luc)的胰腺移植至野生FVB/NJ 或異源BALB/c lianzuomeisuyoudaotangniaobingshutinei，liyongshengwufaguangxitongdedaodefaguangxinhaolaizhishitineiyizhiwucunhuoqingkuang
，bingyutineixuetangshuipingjiyizhiweidianzuzhixuejieguojinxingxiangguanxingfenxi

，keyidedaoyoujiazhidexinxi。

圖1 不同熒光染料的激發光譜曲線

圖2A 麻醉裸鼠四種染料試製的分布/ 圖2B 四種染料試製混合注射到裸鼠體內觀測試製分布

圖3  注射500 pmol Cy7、Cy7-c(RGDyK)

、Cy7-E[c(RGDyK)]2、 or Cy7-E{E[c(RGDyK)]2}2的皮下U87MG腫瘤小鼠在2min

、30min、1h、2h、4h

、24h時間內的全身NIR熒光成像

圖4（A）注射Cy7-RGD 500pmol的U87MG腫瘤小鼠體內NIR熒光成像，實驗組和對照組均注射200μg/小鼠c(RGDyK)，箭頭代表腫瘤的位置

（B）在2小時後無創成像後解剖的U87MG腫瘤和主要器官和組織的代表性熒光圖像。從左到右：U87MG腫瘤，肌肉

，肝髒，腎髒和腸